摘要：H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在，给养鸡业造成巨大的经济损失，危害人类健康。流感病毒抗原易漂移、易转化，给流感病毒的防治带来困难。疫苗接种是预防和控制禽流感最有效的手段之一。全病毒灭活疫苗保护效果好，制备简单。它是流感病毒的常用疫苗。然而，疫苗的局部副作用很大，并伴随着生物安全问题。随着分子生物学技术的发展，新型疫苗如活载体疫苗、核酸疫苗、vacc亚单位疫苗等也在不断发展为H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除了具有传统疫苗的保护作用外，在生物安全性和普遍防控方面具有广泛的优势，这是流感病毒疫苗的一个新的发展方向（

关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；禽流感疫苗

是由禽流感病毒（AIV）引起的一种高度传染性疾病。鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽、野鸟、水禽、海鸟均可感染。甲型流感病毒属于正粘病毒科。其基因组为负义单链RNA，分为8个片段。根据e血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性，甲型流感病毒可分为几个亚型。目前已发现16个HA亚型和9个Na亚型。甲型流感病毒具有宿主特异性。H5、H7和H9亚型通常在家禽中感染。H9N2亚型禽流感病毒于1966年从北美的土耳其首次分离，1994年开始在中国大陆家禽中出现，近年来[1]在经济家禽中广泛流行。H9N2亚型虽然是一种低致病性禽流感病毒（LPAIV），但它能引起蛋鸡产蛋量的严重下降，增加肉鸡和雏鸡的合并呼吸道疾病和死亡率，常造成严重的经济损失锿。1999年出现的H9亚型禽流感病毒感染人类事件给人类健康带来了巨大威胁。H9亚型禽流感病毒在经济和公众健康方面发挥着重要作用，越来越受到人们的重视。与其他病毒性疾病一样，没有有效的方法来预防禽流感。疫苗接种是预防禽流感发生和传播的最有效途径。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，为研制新型禽流感疫苗提供了理论依据和技术手段。除传统的灭活疫苗外，我们还探索了载体活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。这个爸爸综述了近年来H9N2亚型禽流感疫苗的研究现状（

1灭活疫苗

全病毒灭活疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚尿囊增殖液，辅以佐剂制成，具有良好的免疫效果。根据需要，我们可以制备多种不同亚型病毒的多价疫苗。李明义等[2]分别用a型禽流感病毒a/鸵鸟/丹麦/77420/96（lpai-h5n2）株和a/鸡/上海/1/98（H9N2）株接种易感鸡胚，收获感染鸡胚液，超滤浓缩，甲醛灭活，乳化用佐剂。疫苗对4周龄SPF鸡是安全的。用一剂疫苗接种4周龄SPF鸡进行药效试验。免疫鸡全部得到保护，对照鸡全部感染或死亡。结果表明，一种疫苗至少有8个免疫剂量。免疫干扰试验表明，两种抗原具有协同作用（

禽流感、新城疫和传染性支气管炎对鸡的危害较大，免疫程序相似。为了减少疫苗接种数量，达到更好的保护效果，研制了更多的联合疫苗用于免疫预防和控制。刘殿章等[3]制备了灭活油佐剂（乳剂）（1）用鸡胚增殖和灭活本地分离的H9禽流感病毒株和lasota新城疫病毒株的方法接种H9禽流感和新城疫疫苗。经效价试验和激发试验，5日龄白羽肉仔鸡抗体效价可达1∶ 免疫后32～15天，能保护免疫鸡免受禽流感病毒的自然感染，新城疫病毒抗体滴度也达到较高水平。2007年1月，洛阳普莱科生物工程有限公司宣布研制成功禽流感（H9N2）、新城疫、传染性支气管炎三联灭活疫苗。临床试验三万多只鸡证实疫苗安全有效。禽流感三联疫苗不仅有效解决了新城疫、传染性支气管炎、禽流感等三种病毒病在生产应用中存在的免疫程序封闭、免疫相互干扰、反复免疫应激等重大问题，但成本也仅为单一疫苗总成本的50%。灭活疫苗制备工艺简单，免疫保护效果好，能有效避免禽流感的大规模爆发和流行（

2基因重组活载体疫苗

重组鸡痘病毒疫苗是一种g基因工程疫苗具有深入的研究和广阔的应用前景。构建重组鸡痘病毒的载体一般为鸡痘病毒疫苗株，毒副作用小，安全性高。扩增禽流感病毒HA基因，将其插入鸡痘病毒载体中表达HA蛋白。陈平平[4]将H9亚型禽流感病毒HA基因克隆插入载体pfg11s，与鸡痘病毒疫苗株（wfpv）共转染鸡成纤维细胞（CEF），获得重组病毒rFPV-PS-HA，经间接免疫荧光证实。1日龄SPF鸡皮下接种病毒。接种后15天，病毒受到H9亚型禽流感病毒F株翼静脉。在激发后第5天，收集泄殖腔拭子样本以分离病毒。结果发现，疫苗组能抑制病毒的排泄，激发对照组泄殖腔的排泄率明显高于气管。陈素娟等[5]利用相同的技术构建了表达H5和H9亚型禽流感病毒分离株血凝素（HA）基因的重组鸡痘病毒。初步动物实验表明，重组鸡痘病毒免疫SPF鸡后，HI抗体阳性率为100%（8/8）；重组病毒可以54001

亚单位疫苗是一种能诱导机体产生保护性免疫应答的无核酸疫苗。禽流感亚单位疫苗是通过提取禽流感免疫原性蛋白，加入佐剂制备而成。随着重组DNA和分子克隆技术的发展，表面基因可以连接到载体质粒上，然后转入表达系统。在诱导后，可获得大量表达的免疫原性蛋白，并可加入佐剂以使基因工程亚单位疫苗

Purko P等人（7）扩增H9N2亚型流感病毒A/香港／1073/99（H9N2）株的HA、NA和M1基因，克隆到pFASTBAC1杆状病毒中。病毒转移载体转染昆虫细胞系Sf9，获得大量表达的ha、Na和M1蛋白，并自动组装成直径为80nm-120nm的病毒样颗粒，肌肉注射免疫BALB/c小鼠。抗体效价在104～105之间，能有效地防止流感病毒在上呼吸道和肺部的复制。pushkop等人[8]在重组HA蛋白中加入了novasome佐剂，增强了重组蛋白的免疫原性。重组蛋白用量少，免疫效果好。杆状病毒表达系统由于具有翻译后活性，在亚单位疫苗的研制中具有良好的应用前景cessing是利用重组DNA技术将编码保护性抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体中，比原核表达蛋白（

4核酸疫苗

核酸疫苗更接近病毒蛋白的原始构象，又称DNA疫苗。将其直接导入动物体内后，表达保护性抗原蛋白原蛋白基因表达的抗原蛋白通过内源性途径进入免疫系统，诱导特异性体液和细胞免疫应答。邱姆兹等[9]用H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/江苏/7/2002株感染BALB/c小鼠。五代之后，a/chicken/sunjian/7/2002株能在小鼠肺内稳定增殖并杀灭小鼠。用表达H9N2亚型HA和NA基因的核酸疫苗免疫小鼠。在第一次或第二次免疫后，用致死剂量的a/鸡/江苏/7/2002株攻击小鼠。观察小鼠存活时间，测定血清抗体滴度和肺组织病毒残留滴度，评价其免疫保护作用。结果表明，10μ 表达HA和NA基因的DNA疫苗能有效地保护H9N2亚型禽流感病毒免受攻击（

核酸疫苗能长时间表达抗原，避免母蚁的干扰而且没有病毒散播和毒力上升的危险。然而，目前研制的核酸疫苗存在着体内表达效率低、免疫保护效果差等缺点，需要进一步研究才能用于实际生产（

5通用疫苗

具有多种禽流感病毒亚型，而各亚型表面抗原基因易漂移和转化，是流感病毒防控的难点。如何找到一种对各亚型具有交叉保护作用的通用疫苗是流感病毒防治策略之一。研究表明，甲型流感病毒M2蛋白在亚型间相对保守，它是一种有效的疫苗靶标，为通用疫苗的研制奠定了理论基础[ 10 ]。Ernst-wa等[11]扩增了流感病毒H1、H5、H9亚型M2蛋白外功能区m2ea表位片段，并与疏水蛋白（如pET28a）融合构建表达载体进行融合表达。脂质体佐剂免疫小鼠。结果表明，m2ea表位疫苗能刺激机体产生抗m2ea表位IgG抗体，显著降低流感病毒在呼吸道的复制和增殖。用致死剂量的H1N1和H9N2亚型对小鼠进行攻击，保护率为100%保护率分别为100%和8%。结果表明，M2EA表位疫苗对流感病毒亚型有一定的保护作用，为流感病毒通用疫苗的研究奠定了基础

6反向遗传学在鸟类流行性感冒病毒亚单位疫苗

反向遗传学研究中的应用，又称拯救病毒，是近年来一种新的研究方法，应用于病毒研究。病毒拯救技术是在了解病毒复制特性的基础上，运用分子生物学技术建立和完善的。它是通过基因的人工操作，利用适当形式的病毒核酸来实现的在一定条件下感染细胞产生传染性病毒颗粒。经过多年的发展，现在的病毒拯救是指基于质粒的系统，即从克隆的cDNA中产生病毒的过程[12]。病毒拯救在病毒生命周期、基因结构与功能、致病基础、新疫苗构建、外源蛋白表达等方面的研究显示出良好的应用前景[13]。Neumann g等[14-15]分别报道了基于质粒的流感病毒拯救，它可以对流感病毒基因进行人工操作，引入预期的突变位点，使重组病毒具有预期的（冷适应、减毒等）表型，为流感病毒的研究提供了有力的工具他正在开发新的流感病毒疫苗。反向基因技术已成功应用于人用流感减毒活疫苗的研制。在2003年，flummist？美国利用反向基因技术研制出一种三价流感减毒活疫苗？流感减毒活疫苗经批准投入使用，对成人和儿童具有良好的安全性，能有效预防流感[16]。该技术已应用于禽流感病毒的研究。石火英等[17]利用反向遗传学技术，将1998年从中国大陆分离的H9N2亚型禽流感病毒的8个基因片段转染COS-1细胞，制备了H9N2亚型禽流感病毒H9N2亚型禽流感病毒具有与野生病毒相同的生物学特性。利用反向遗传技术，可将致病力较低的H9N2亚型禽流感病毒作为骨架病毒，与不同毒株的HA和NA基因相互作用，合成重组病毒作为候选疫苗。可以预见，反向基因技术将是未来研制禽流感病毒疫苗有效候选株的有力手段（

7结论

禽流感病毒亚型多、分布广、传播途径复杂。病毒本身的特性和疫苗选择的压力使病毒容易重组和重排，导致抗原性的改变致病性强，导致免疫功能衰竭。这些特点给禽流感的防控带来了很大的困难。H9亚型禽流感病毒对鸡的致病性低，容易被忽视。因此，对禽流感病毒进行持续的分子病毒学监测，分析禽流感病毒的变异规律，筛选合适的疫苗株系，应用先进的分子生物学技术，开发高效、安全的疫苗，简单的工艺和高质量的疫苗株需要低成本的禽流感疫苗是禽流感病毒研究者的方向（

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