新孢子虫病是一种由犬新孢子虫（Neospora caninum Dubey，1988）寄生于狗、牛、羊等动物细胞内引起的原生动物疾病。1984年，挪威兽医jcerkas在患有脑炎和肌炎的幼犬身上首次发现了这种疾病。1988年，杜比博士将其命名为犬新孢子虫。犬新孢子虫的最终宿主是狗。牛、羊、狗、马、鹿和老鼠可作为中间宿主。虽然新孢子虫病是多种家畜常见的一种原生动物疾病，但它对牛的危害特别大，主要引起奶牛流产、死产和新生儿运动神经系统疾病。同时，该病可以垂直传播，被感染的奶牛可以直接传播t他给新生的小牛喂食。实践证明，这是造成乳品行业严重经济损失的重要原因。由于每年从欧美及周边国家大量引进种牛或商品牛，该病很可能传入中国。诊断是防治本病的关键。本文综述了近年来国外学者对奶牛新孢子虫病的诊断方法，以供参考（

1临床诊断

产前诊断主要依靠临床症状的观察。该病可全年发生，但高峰出现在夏季。两组感染无年龄差异雄性动物。血清阳性胎儿在妊娠6个月前流产的比例较高。这种疾病引起的流产通常是散发性的或地方性的。因此，当雌性动物发生流产、死胎、新生儿麻痹、畸形、共济失调和肌肉萎缩时，当出现抽搐或其他运动神经系统疾病症状时，特别是在一组或多组中，应怀疑新孢子虫感染（

2病原学诊断

2.1病理组织学检查

根据N。卡尼努姆，N。犬可在新生儿肌肉、脑组织、呼吸道分泌物、皮肤脓肿等活组织中检出。流产胎儿的脑、脊髓、心脏和肝脏应收集进行常规组织学检查。可见多灶性、非化脓性脑炎、神经炎、心肌炎、骨骼肌炎、肝炎及细胞浸润等，但要作出明确诊断，必须进行检查。对犬速殖子和（或）组织囊肿进行了检测（

2.2病原菌的分离与培养

，以分离和培养N。犬，采集待检动物的病变组织，匀浆后接种于小鼠、大鼠、沙土鼠、狗、猫、兔皮下。接种剂量因动物种类而异。发病后，收集中枢神经系统或内脏组织进行特异性试验，并进行传代接种。N犬已成功地进行了体外培养。可在牛肾细胞、Vero细胞等细胞系中生长发育。Davison等人[6]（1997）用0.5%胰蛋白酶匀浆消化了约10g的死胎犊牛新鲜脑组织，并将其接种在6个Vero细胞上。在含有5%二氧化碳和95%空气混合物的RPMI-1640培养基中，细胞在37℃培养℃ ° 在C。典型的N。犬速殖子在接种29天后首次在一种培养基中观察到。Ya mane等人[7]（1997）收集了16个疑似新孢子虫病的流产胎儿和犊牛的组织样本，并将其接种到牛心肺aort中内皮细胞和猴肾细胞培养。N接种后49天在一个细胞内观察到犬速殖子。结论：病原菌的分离和体外培养可用于新孢子虫病的特异性诊断（取死亡动物的脑、脊髓、肝、肾、胎盘或其他病理部位进行免疫组化染色）。犬血清。犬可引起弓形虫的特异性感染，但不能引起弓形虫等原生动物的感染。其中一种是亲和素-生物素-过氧化物酶（ABPC）染色。林赛用兔抗-N。犬血清染色组织切片，检测新孢子虫速殖子和缓殖子。然而，它是由于未感染弓形虫、哈维氏钩虫、奎氏肉孢子虫和冻贝诺菌，家兔对弓形虫有抗药性，血清对N。犬（

3血清学诊断

有效的血清学检测是准确诊断牛流产、开展新孢子虫病传播的流行病学调查以及鉴定其它中间宿主和终末宿主的必要条件。卡尼姆。目前，牛N。报道了犬源性抗体，包括IFAT、westernblot、凝集试验和ELISA。IFAT和ELISA应用广泛，检测结果的特异性和灵敏度高[9,10]（

3.1间接荧光抗体试验（IFAT）

N。将Vero细胞系培养的犬固定在玻片上。抗N抗体效价。血清和初乳中犬IgG的测定采用if-at法。血清中IFAT抗体效价为1200～11600，最高可达16400，脑脊液中也可检出IFAT抗体。此方法特别适用于先天性N。犊牛的犬病感染。该方法特异性强，灵敏度高。动物血清稀释100倍，与弓形虫无交叉反应[2,9,11]。Okeoma和Williamson检测了269份自然感染N。用不同抗体滴度的IFAT检测犬。结果表明，抗体效价虽有波动，但显色性明显下降N的ome带型。同一IFAT滴度组犬速殖子抗原仍相同。该方法可用于识别N。犬速殖子抗原[12]（

3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）

在现有的研究中，ELISA检测方法主要是基于天然n。氨抗原或重组n。canmum抗原，或N。犬抗体活性和N。犬特异性竞争抑制单克隆抗体（mAbs）。目前已研制出一种有效的ELISA诊断试剂盒。其中以单克隆抗体（mAb）和N。犬类应用广泛，诊断的特异性和敏感性高[9,10,13]（

3.2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前有效的N。研制了犬

ELISA诊断试剂盒。Williams[14]和其他学者估计了ELISA试剂盒在检测n。牛血清中cqninum抗体，并与IFAT进行比较。根据试剂盒说明书，检测结果小于20pp的样品为阴性，检测结果在20-25pp范围内的样品为可疑样品，检测结果大于25pp的样品为阳性样品[PP为检测样品OD值与阳性对照血清平均OD值的百分比（IFAT滴度为15120）]。结果表明，该方法比IFAT法可靠、特异、灵敏。另外，ELISA也可用于检测N。牛奶中的犬抗体. Schares g、barwald A等人用ELISA法检测牛奶中的新孢子虫抗体。有人指出，稀释率为12时的实验结果与相应的血清检测呈线性相关[15]。临床试验结果表明，biovet-ELISA试剂盒和IDEXX-ELISA试剂盒的特异性和敏感性均在95%以上，可作为牛N。犬抗体[14]（在原有研究的基础上，改进了基于单克隆抗体（mAb 4a4-2）的竞争抑制酶联免疫吸附试验（cielisa）。改进的ELISA方法采用特异性单克隆抗体（Freund完全佐剂中的5b6-25）捕获天然N。加利福尼亚州ninum抗原可与竞争性单克隆抗体（mab4a4-2）直接结合，单克隆抗体可与不同的表位结合而保守，主要用于免疫65kdan。犬速殖子表面抗原（nc-1分离物）。Cielisa法可减少非特异性抗体的结合，并允许应用未稀释血清提高诊断的特异性和敏感性。方法的灵敏度和特异性分别为97.6%和98.6%，表明该方法对N。卡尼姆。N犬cielisa的特异性依赖于mab4a4-2，可直接与抗原结合。因此，没有必要对cielisa和cielisa进行改进其他辅助试验，如凝集试验。Cielisa是一种快速、灵敏、准确的检测牛N。犬抗体（N。基于牛血清表面抗原的ELISA

中的犬。卡尼姆。N。犬可作为新孢子虫病的重要诊断试剂。Ncsag1是N。卡尼姆。Cha Han等克隆了缺失信号肽和C端疏水功能区的ncsaglt基因，并在大肠杆菌中表达。大肠杆菌与谷胱甘肽-s转移酶（GST）的融合蛋白。将纯化的gst-ncsag1t用于牛新孢子虫抗体的ELISA检测。这种方法可以区分IFAT阳性和IFAT阴性牛血清间存在交叉反应，与实验性弓形虫感染小鼠无交叉反应。Howe和Tang[19]（2002）研究了n。并设计了检测牛血清中特异性抗体的ELISA方法。Ncp29是由弓形虫特异性sagl基因同源基因编码的重组表面蛋白。实验结果表明，该方法可用于牛血清中特异性抗体的检测。犬（[od]大于1.2，稀释度1500或更高）和阴性对照组（[od]小于0.5，稀释度1500）被迅速区分。另外，酶联免疫吸附试验结果从弓形虫和奎氏肉孢子虫中分离的血清均为阴性，因此rncp29r-ELISA检测弓形虫和奎氏肉孢子虫具有较高的特异性和敏感性。犬抗体。Hye Jin-Ahn和sera Kim等人（2003）研究了另一个N。犬表面抗原ncp43（N。犬韩国株）。ncp43的表位位于23个C末端（son等人，2001）。将纯化的GST与ncp43的23个C-末端（p-片段）融合（相对较短的6xHis无特异性标记可代替GST），作为抗原设计ELISA试验。结果表明，弓形虫ncp43和tgsagla可用于弓形虫的鉴别诊断。不同哺乳动物的犬和弓形虫感染[20,21]。此外，se其他几种重组N。犬抗原nc4.1和nc14.1也可作为重组蛋白用于ELISA检测特异性N。犬抗体[19]（

4分子生物学诊断

目前，聚合酶链反应（PCR）广泛应用于奶牛N。犬病

。该方法以N。本方法适用于感染细胞培养基和福尔马林固定石蜡包埋组织中病原体的检测

4.1间接原位PCR

本方法由loschen BER ger et alCaninum建立，是一种特异性和敏感性高的新方法。可替代免疫组化法。它可以用半抗原标记核苷的PRINS反应检测或用荧光染色体标记抗体（

4.2pcr检测nc-5基因

Paula等人（2004）采集了12头2岁5月龄流产牛的血样和分离的DNA。用Np21+和NP6+引物扩增了N。用tim3和tim11引物扩增itsi。实践证明，该方法是有效的。Fernandez和mora（2002）设计了第二种定量检测N。流产牛胎中的犬齿。他们设计了寡核苷酸引物来扩增N。caninum nc-5序列。结果表明，该PCR方法能有效地检测出大肠杆菌用于新孢子虫病的定量检测。此外，Mü Fowler和vonlaufen（2002）设计了第二种荧光PCR方法来定量检测大鼠中枢神经系统组织切片中的新孢子虫。这种采用双荧光杂交技术的PCR可以有效地检测脑组织中的新孢子虫[25]（

4.3单管巢式PCR

el lis，McMillan等人[26]（1999）描述了一种单管巢式PCR技术，具有两个连续的步骤来检测新孢子虫。这种PCR诊断方法对靶序列N的特异性复制产物特别敏感。从福尔马林固定和石蜡包埋的自然感染catt组织样品中可以扩增出犬DNA从而达到乐和犬临床诊断的目的。还描述了PCR模拟。这项技术在氮的研究中的实用性还需要进一步的研究。结论

在奶牛N。犬病应结合临床症状、流行病学及组织病理学变化特点，采用多种检测方法进行综合诊断。血清学检测和PCR检测是诊断N。奶牛的犬病。以N。犬特异性表面抗原与竞争抑制因子克隆抗体很高。适用于N的检测。感染细胞培养基和福尔马林固定石蜡包埋组织中的犬病原菌。在实际工作中，应根据实际情况选择合适的新孢子虫病诊断方法（

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