童桂芝，宋斌，董正德

（黑龙江省齐齐哈尔市黑龙江畜牧研究所，黑龙江省161005）

摘要：卵母细胞收集方法可分为两类：从屠体卵巢收集卵和在体收集卵。从屠体卵巢收集卵子主要有抽吸法和切割法。其优点是成本低，可以变废为宝。缺点是胚胎谱系尚不清楚。活体卵子采集有两种：腹腔镜卵子采集和超声引导下阴道穿刺卵子采集。其优点是对母羊危害小，母羊利用率高，胚胎系谱清晰。影响卵母细胞质量和产量的因素：激素血清、卵泡液、生长因子等。本文介绍了绵羊卵母细胞采集及体外成熟影响因素的研究进展（

关键词：绵羊；卵母细胞；鸡蛋收集；体外成熟

分类号：s826.3文件识别码：a品号：2095-9737（2016）09-0007-02

绵羊卵母细胞体外成熟（IVM）是体外胚胎生产（IVP）、转基因动物生产和辅助生殖（Art）技术的基础和关键。通过向成熟培养基中添加激素和生长因子，在促进卵母细胞成熟方面取得了一些进展[1]。目前，影响绵羊卵母细胞体外成熟的因素有（

1收集1.1从屠体卵巢收集卵母细胞

从屠体卵巢获得的卵母细胞主要有抽吸法或切割法。抽吸法是用18号或20号针头从卵泡中提取卵母细胞。卵裂法是切割卵巢组织并分离卵母细胞。这两种方法可以在不同阶段获得大量的卵母细胞。这种方法最大的优点是原料来源丰富，成本低，但是很难确定雌性动物的系谱[2]（

1.2活卵收集

1.2.1腹腔镜取卵腹腔镜取卵技术

腹腔镜取卵腹腔镜取卵技术[3]是一种新技术非常简单和高效。这项技术是快速，廉价，可以重复没有并发症。常规麻醉后，收集卵子大约需要20分钟。腹腔镜卵子收集可用于通过精心梳理的母羊。每只绵羊每周可采集两次卵，卵母细胞回收率为68%。平均而言，每只母羊每发情周期可收集4.6个卵母细胞。超排山羊卵母细胞回收率为75%～85%，平均每只山羊可获得13.5个卵母细胞。这项技术的主要缺点是，用吸管吸吮卵泡中的卵母细胞会导致卵丘细胞的丢失（

1.2.2超声引导阴道穿刺采卵

超声引导阴道punc真卵收集[4]是一种安全的卵母细胞收集方法。卵母细胞回收率与腹腔镜卵母细胞采集相似，但可看到和提取的卵泡数少于腹腔镜卵母细胞采集。ECG和FSH单独或联合治疗后最好收集卵子，以增加可恢复卵泡的数量。这项技术已经在山羊身上得到应用，但要掌握这项技术需要大量的实践（

2.影响卵母细胞成熟的因素

2。。1激素在卵母细胞成熟中起重要作用

，促性腺激素（FSH和LH）和17被添加到成熟液中β-雌二醇可以提高卵母细胞的成熟率。促性腺激素是最重要的哺乳动物核体外成熟的n调节因子。成熟液中添加促性腺激素有助于羔羊卵母细胞的成熟。雌二醇可能刺激DNA聚合酶β，这两种物质都参与细胞质成熟。FSH可诱导卵丘细胞增殖，暂时抑制生发泡破裂，延迟首次成熟和分裂时间，促进细胞质成熟。LH能增强卵母细胞的活力，引起卵丘细胞的变化，促进精子受精。在对绵羊卵母细胞的研究中，人们添加了不同浓度的FSH和LH，O’Brien添加的FSH和LH量为10μg／mL[5]（

2。。2卵巢运输时间和温度

bovin从屠宰场获得了绵羊卵巢。运输温度和时间很重要。当牛卵巢在37~39℃下储存8小时时，卵母细胞成熟率降低，在25℃下储存8小时后，成熟率没有显著变化（Yang等人，1990）[6]。Moodie等人[7]结果表明，在22℃下保存数小时的绵羊卵巢对卵母细胞成熟率没有显著影响；在体温作用下，卵母细胞的成熟率显著降低。孙桂金等（2006）[8]表明，28℃下的卵母细胞成熟率明显高于22℃和35℃下的卵母细胞成熟率。37℃接近绵羊的体温，卵巢的生理活性较低在体外环境中，卵巢不能获得足够的营养，导致卵母细胞中某些物质的降解。卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响机制有待进一步研究（

2。。3血清对卵母细胞体外成熟的影响

成熟液中通常加入10%~20%的热灭活血清，因为血清可以为COC提供营养，防止透明带硬化[9]。大多数绵羊卵母细胞在体外用FBS成熟。虽然成熟液中可能不添加发情山羊血清（EGS），但在添加10%FBS、10%EGS或10%ess的成熟液中培养的山羊卵母细胞可获得较高的成熟率分泌促性腺激素。向成熟液中添加5%发情牛血清可提高绵羊卵母细胞的成熟质量（赵晓娥等，2005）[10]实验表明，当绵羊卵母细胞在体外成熟时，添加血清可显著提高成熟率（

2。。4生长因子

、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）都会影响卵母细胞体外成熟[11]。绵羊的表皮生长因子（EGF）和卵泡成熟因子也可能影响绵羊卵母细胞的生长和成熟。在表皮生长因子存在下，绵羊卵母细胞可以获得更多的卵丘细胞扩增和更高的受精率。EGF的加入是必要的低3ng/ml对山羊卵母细胞体外成熟无明显影响。在成熟液中加入50NG/mlegf可提高山羊胚胎的生产效率。70%以上的卵母细胞通过在成熟液中加入神经生长因子恢复减数分裂。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）不影响卵母细胞成熟[11]。将EGF添加到卵母细胞成熟培养基M199中，发现浓度为（1,10,100 pg/L）可促进卵丘扩张，显著增加达到M II期的卵母细胞比例。艾继辉（2003）[12]等证明EGF可以促进裸卵的成熟率。Lu Jin等人（2005）[13]表明，IGF-1单独由颗粒细胞分泌或与促性腺激素协同分泌n促进卵母细胞成熟。宋凯等人（2014）[14]在本实验中，在成熟培养阶段，仅向不同培养基（血清培养系统、FBS和牛血清白蛋白培养系统、BSA）中添加不同浓度的VEGF（5ng/ml和10NG/ml）。结果添加血管内皮生长因子（VEGF）的两个实验组卵母细胞成熟率分别提高到84.61%和82.87%（P<0.01）；在BSA系统中，两个实验组的成熟率分别提高到82.40%和79.21%（P。VEGF可能与血清中的未知因子协同作用，有效提高绵羊卵母细胞的体外成熟率

2的作用）。。5卵丘细胞

黄成军等（201）4） [15]表明，添加离散卵丘细胞可显著促进机械裸卵（DOS）的体外成熟（57.98±14.27 vs 35.53±14.00，P<0.05），并促进卵丘-卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著（76.66±5.77 vs 66.76±9.46），卵母细胞外卵丘细胞对共培养DOS体外成熟的影响不明显（35.83±18.32 vs 35.53±14.00，P>0.05）。结果表明，离散卵丘细胞的加入主要通过旁分泌途径促进卵母细胞体外成熟；三层或三层以上的细胞外卵丘细胞可使其包被卵母细胞的平均体外成熟能力提高85.34%使COC的平均体外成熟能力提高16.18%，do提高60.61%（

2。。卵泡直径、卵泡直径与卵母细胞成熟率相关

卵泡直径、卵泡直径与卵母细胞成熟率相关。Crozet等人[15]的实验表明，成年山羊的卵泡直径与卵母细胞成熟和早期胚胎体外发育直接相关。卵母细胞来源于直径大于5mm的卵泡的体外成熟，体外受精和胚胎培养发育为囊胚的能力明显高于小卵泡。然而，性未成熟山羊卵巢中的卵泡直径大多为2.5~3mm，因此我认为从性未成熟的山羊身上收集直径大于5mm的卵泡是很困难的。因此，性未成熟山羊卵母细胞的发育能力低于成年山羊。卵母细胞直径与其发育能力直接相关，直径大于135μM的山羊卵母细胞发育能力最强，直径小于110μM的山羊卵母细胞不能成熟发育。大直径山羊卵母细胞发育能力强可能与MPF活性有关。体外成熟培养后，大直径山羊卵母细胞的MPF活性显著高于小直径山羊卵母细胞。石文生（2008）[16] 结果表明，在直径为2mm的卵泡中，卵母细胞的体外成熟率较高≤ D≤ 8mm明显高于直径8mm

2）有显著性差异。。褪黑素

活性氧（ROS）的作用是决定卵母细胞成熟、胚胎发育和形态变化的重要因素。王超（2011）[17]发现，在牛卵母细胞体外成熟过程中添加10~50NG/ml褪黑素可以促进来自mⅠ 到mⅡ, 提高细胞核成熟率，促进细胞质线粒体的均匀分布和卵丘的扩大。卵母细胞体外成熟过程中氧浓度和褪黑素的作用；在高氧浓度下，褪黑素能显著促进牛卵母细胞成熟，这意味着褪黑素的作用取决于培养条件。李晓霞等（2015）[18]，添加10 m褪黑素可显著提高牛卵母细胞的成熟率（62.5 vs 77.8）（P<0.05）；受精后体外发育胚胎的卵裂率（53.2 vs 67.6）（P<0.05）和囊胚率（20.3 vs 35.4）。裸卵暴露于活性氧导致减数分裂静止和卵母细胞变性。卵母细胞在不同时期抗ROS的能力决定了卵母细胞的发育能力（

）近年来，绵羊卵母细胞采集技术和体外成熟技术取得了很大进展，大大提高了体外胚胎移植的妊娠率和产羔率。理解明确卵母细胞成熟的分子水平调控机制，有助于找出影响胎儿和胎盘发育的因素，胎儿异常和妊娠异常的原因是体外胚胎，最终提高体外生产胚胎的质量和效率，转基因羊和克隆羊（

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