为探讨卵丘细胞对体外成熟卵母细胞体外受精的影响，采用卵丘细胞去除组、部分去除组和非去除组。让我们来看看：卵丘细胞对绵羊体外受精

体外受精作用的实验分析：卵丘细胞对成熟卵母细胞的体外受精包括：吸引、阻断和筛选精子；获能、顶体反应和精子穿透；防止卵母细胞过早硬化。本研究旨在探讨卵丘细胞对成熟卵母细胞体外受精

的影响奥特豪斯。屠宰绵羊为德国肉用美利奴羊与小尾寒羊杂交种

1.2主要仪器设备

倒置显微镜：美国mss100；超净控制台：超低风机过滤装置，美国加州Enviroco；C02培养箱：（美国赛默）；离心机：CN 820，MRC，Ltcl，以色列；恒温板：kh-p431；水浴锅：天津华仪信达仪器，hh-4.1.3主要试剂及制剂所用试剂

，除另有规定外，均向西格玛采购。胎牛血清（FCS）和Bo液购自GIBCO，促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和雌二醇（E2）购自宁波激素厂，并用培养皿进行了实验从丹麦nunc公司重新购买（

发情绵羊血清（ESS）；取卵液：中药-199+10iu/ml肝素+2%FCS；成熟液：TCM-199+10%FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml E2；精液冲洗：sof溶液+洗液g/ml，肝素+10%ess；接受精液：sof溶液+3mg/mlbsa+10mg/ml，肝素+20%ess+10-9mol/L褪黑素（

1.4实验设计

体外受精实验设计为第3组：无卵丘细胞去除组、部分去除组和去除组。实验1各组均与卵丘细胞共培养；实验2各组均与褪黑素共培养；在实验3中，每组都与卵丘细胞相互作用d褪黑素（

2.方法

2。。从屠宰场取出1个卵母细胞

卵巢，置于30℃双抗体生理盐水中。3小时内带回实验室。吸入约2ml。用10ml注射器吸取卵巢表面2～8mm卵泡液。在固体显微镜下观察

2的体外成熟。。2卵母细胞

卵母细胞体外成熟的培养方法为石蜡油覆盖的微滴培养法。将6~8滴（100%）滴在直径为35 mmμL/滴的细胞培养皿上，在培养箱中预平衡2h。在38.5℃、5%coz和sa条件下进行成熟培养24小时的饱和湿度。记录培养卵母细胞数（

2）。。3体外受精

将新鲜精子注入含有3毫升洗精45的离心管底部，倾斜并在38.5℃，5%二氧化碳和饱和湿度的培养箱中漂浮30分钟，然后从上层吸取2毫升洗精转移到另一个灭菌离心管中，加入5ml精子洗涤液，以1200r/min离心5min，弃去上清液，用精液×L06lml稀释至1ml，于受精前2h取精子密度进行体外受精（

，制备小滴精液，每滴50t/L，涂上石蜡油，置于C02培养箱中为了平衡。在精子处理的同时，用200rul移液管反复吹扫培养的成熟COCs。把鸡蛋分开。清洗3次后，将15~20个COCs或（裸卵和半裸卵）转移到每滴受精液中。然后将培养皿置于38.5℃、5%C02和饱和湿度的培养箱中进行体外受精（

2。。4卵丘细胞

的制备

取收集的COC，用透明质酸酶去除周围的卵丘细胞，去除机械裸卵（DOS），离心剩余液体，用精液冲洗3次，最终密度调整为L06~2×L06片/ml

卵丘细胞共培养液滴的制备：制备前培养液滴在50μL～50μL的浓度范围内，每滴卵母细胞的添加量为50μL/L，每滴卵母细胞的添加量为50μL。在5%coz、95%空气、饱和湿度、38.5℃培养23~24小时后，用胰蛋白酶去除周围卵丘细胞，计数各组受精率（

2）。。5早期胚胎体外培养

将假想的受精卵移入胚胎培养基sof中，冲洗3次，用吸管轻轻反复吸吮，除去附着在受精卵上的卵丘细胞和精子。然后，在胚胎培养基sof中洗涤两次后，将其转移到平衡的培养液中提前在培养箱中培养2小时。将20～25枚受精卵分别移入100枚卵中，在38.5℃和5%Co的条件下，分别加入2%必需氨基酸、1%非必需氨基酸、2mmol/L谷氨酰胺、3mg/ml牛血清白蛋白、10ng/ml表皮生长因子的μL胚胎培养基，在饱和湿度的培养箱中培养7～9d。每48小时更换一次培养液，每48小时计数一次卵裂率。第7～9天

2计数囊胚率。。6统计学分析

采用SPSS统计软件@独立样本t检验和单因素方差分析（

3.结果与分析

3.1卵丘细胞的加入对clea的影响体外成熟卵母细胞迷走神经率和囊胚率

表1显示，与对照组相比，添加卵丘细胞能显著提高有卵丘细胞组和无卵丘细胞组体外成熟卵母细胞的卵裂率和囊胚率（P<0.05）；与部分切除组相比，在一定程度上提高了非切除组的卵裂率和囊胚发育率，但差异不显著（P>0.05）：部分切除组的卵裂率和囊胚发育率优于非切除组，但差异不显著（P>0.05），但显著优于对照组

　　3.2　抗氧化剂对ooc的影响结果表明，与对照组相比，精液中添加褪黑素能显著提高卵丘细胞完全去除、部分去除和不去除的成熟卵母细胞的卵裂率和囊胚率（P<0.05）；部分切除组和非切除组卵母细胞的卵裂率和囊胚率均显著高于完全切除组和对照组（P<0.05）；结果表明，褪黑素对卵母细胞受精和体外发育有重要影响

3.3卵丘细胞与褪黑素联合应用对卵母细胞体外受精后卵裂率和囊胚发育的影响结果表明，卵丘细胞与褪黑素联合应用时，卵母细胞体外受精后的卵裂率和囊胚率均明显优于对照组（P<0.05）；部分切除组明显优于切除组（P<0.05），在一定程度上优于非切除组，卵丘细胞对卵母细胞体外受精的影响是卵丘细胞分泌的物质。卵丘细胞在卵母细胞合成谷胱甘肽（GSH）中起着重要作用，因此无卵丘细胞的卵母细胞中GSH含量很低。GSH在精子沉积中起重要作用分子化与雄性原核形成[3]。研究了卵丘细胞对有卵丘细胞和无卵丘细胞成熟卵母细胞的影响，比较了体外受精的卵裂率和囊胚发育率。结果表明，各切除组的卵裂率和囊胚发育率均显著低于部分切除组和非切除组，并达到显著水平。但实验结果显示，所有切除组均能发育囊胚。研究表明，卵丘细胞在卵母细胞体外受精过程中起着吸引、阻断和选择精子的重要作用。一般来说，这是很困难的弱精子在其阻断下接近卵母细胞，因此卵丘细胞部分切除的效果优于未切除组。结果表明，卵丘细胞去除组的卵裂率也明显低于部分卵丘细胞去除组（P<0.05）。在肉羊体外受精过程中，精子活力的下降速度明显快于牛精液，细胞周围的卵丘细胞可能通过精子下降而阻碍卵母细胞的受精。部分去除卵丘细胞可以有效地解决上述问题，这也是实验结果与牛（

不同的一个原因4.2卵丘细胞联合褪黑素对d体外受精后发育

在体外受精过程中，活性氧的不断积累会对精子和卵母细胞受精后的胚胎产生毒性，不利于体外受精胚胎的发育。近年来的研究表明，在精液洗涤、精液接收和胚胎培养液中添加抗氧化剂有助于减缓活性氧的毒性作用，进而提高体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率。褪黑素是哺乳动物松果体分泌的一种胺类激素。能有效清除细胞内的自由基，防止细胞凋亡，保护细胞免受氧应激的影响。当她p胚胎在体外培养，胚胎细胞进行有氧代谢并产生活性氧（ROS）。生物细胞中ROS的含量及其与抗氧化剂的平衡对细胞的正常生长和代谢至关重要。研究表明，高浓度的ROS影响激酶及其转录活性，从而影响细胞活性，延缓胚胎发育，引起胚泡期绵羊胚胎细胞凋亡，损伤DNA和RNA。当ROS低于正常生理值时，会阻断氧化剂在机体增殖和防御过程中的作用

5。结论体外精液中加入卵丘细胞能显著促进精子的增殖和防御裸卵和半裸卵在体外成熟时的剥脱率和囊胚率，对COCs无明显影响；体外精液中添加抗氧化剂褪黑素可提高成熟卵母细胞的卵裂率和囊胚率。卵丘细胞和褪黑素的联合作用更为显著。部分去除卵母细胞周围的卵丘细胞有助于提高卵裂率和囊胚率，其中卵丘细胞部分去除效果最好（

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