牛膝是苋菜科牛膝的干燥根。主要产于河南。具有滋补肝肾、强身健骨、祛瘀通经、引血降血的功效。用于腰膝痛、筋骨无力、闭经、肝阳眩晕等[1]。牛膝是我国的传统中药，历史悠久。首次在《神农本草经》上发表，并被列为上品。因其形似牛膝而得名。主要含有甾酮、皂甙等化学成分。现代药理研究表明牛膝具有抗肿瘤作用刺激子宫[2]，抗骨质疏松[3]，抗衰老[4]，增强免疫功能[5]，改善血液流变学[6]，治疗不孕症[7-8]。小鼠巨噬细胞RAW264.7模型是一种广泛应用的炎症反应模型。现在，我们研究了牛膝汤和甾酮成分对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞分泌NO和TNF的影响-α、IL-1β，以探讨牛膝汤和甾酮成分的抗炎作用，从而为研究牛膝抗炎作用的物质基础和机制提供科学依据（

1.材料

1.1药材和试剂

牛膝北京大学中医系教授张贵军、郭先生、河北省牛膝干根鉴定；D101大孔吸附树脂（上海远野生物科技有限公司）；蜕皮甾酮（成都曼斯特生物科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（GIBCO）；脂多糖（LPS）（sigma）；噻唑蓝（MTT）（Amresco）；DMEM高糖培养基（hyclone公司）；胎牛血清（FBS，北京全时金生物有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）；ELISA检测试剂盒（南京建城生物工程研究所）（

1.2细胞系

小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国农业大学上海细胞库科学院（

1.3仪器

高压釜（上海博顺实业有限公司）、722E紫外分光光度计（上海分光光度计）仪器有限公司、ESCO层流柜（公司）、te2000-5倒置相差显微镜（尼康公司），二氧化碳培养箱（美国thermo公司）、酶标记仪（Perkinlemer公司）、-80℃低温冰箱（美国thermo公司）（

2.方法

2。。1牛膝汤及甾体成分

的制备

以10倍体积的蒸馏水为溶剂，提取牛膝两次，每次2h，与提取物结合，过滤、回收、浓缩减压额定，得到牛膝汤提取物。D101大孔吸附树脂用水、30%乙醇、50%乙醇和95%乙醇洗脱。紫外分光光度法测定蜕皮甾酮。可见，50%的醇洗组分为甾酮组分，50%的醇洗组分在减压（

2）下回收浓缩。。2细胞培养

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞与10%胎牛血清及青霉素（1×105U/L）、链霉素（100mg/L）在37℃、5%CO2的rp-mi1640培养基中培养，次日传代

2。。3对RAW264.7细胞的存活率（MTT法）

进行观察取细胞生长期为2×105/ml，稀释至细胞悬液中，接种于96孔培养板上，100μL/孔，37℃5%CO2孵育24h，弃去上清液，加入100%不同药物浓度的细胞培养基μL/孔，空白对照组加入无细胞培养基，每组6只威尔斯。连续孵育24小时后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μL继续孵育4小时，弃去上清液，每孔加入0.15ml二甲基亚砜使其完全溶解，用酶标仪测定490nm处的OD值。计算细胞存活率。细胞存活率正常对照组的ate为100%。细胞存活率=A490（样本组）/A490（空白对照组）×100%，实验结果见表1（

2。。4个对数生长良好的实验组

细胞随机分为空白对照组、LPS模型组、牛膝汤高、中、低剂量组、甾酮组分高、中、低剂量组。在每个浓度下设置6个复合井，共8个实验组（效应

2。。5在LPS诱导的RAW264.7细胞

分泌NO时，将RAW264.7细胞×105/孔接种于96孔板中，在37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。将培养基丢弃并处理分别用药物和脂多糖治疗。在细胞培养板上加入不同浓度的100μL／孔的细胞培养基，空白对照组加入无细胞培养基，每组6只威尔斯。继续培养4小时，加入LPS至最终浓度1mg/L，继续培养24小时，将0.05mL培养基上清液吸取到新的96孔板中，加入0.05mL等体积的Griess试剂a，室温避光5分钟；然后在相同体积中添加0.05 ml格里斯试剂B。在室温下在黑暗中反应10分钟后，用酶标记仪测量540 nm处的吸光度，并计算rel实验结果如表2（

2所示。。

对RAW264.7细胞的作用为2×105/ml稀释，100μL/孔接种于96孔细胞培养板上。在37℃和5%CO2下培养12小时。将上清液丢弃，在细胞培养板中加入不同浓度的100μL／孔的细胞培养基，空白对照组加入无细胞培养基，每组6只威尔斯，孵育4小时，加入LPS，最终浓度为1 mg/L，继续培养24小时，以3000 R/min的速度获得细胞上清液，离心10分钟，吸收supErnant，按ELISA试剂盒说明书操作，在450nm处读取吸光度值，计算每个孔的TNF-α、IL-1β含量。实验结果如表2所示（

　　2.7统计分析

所有实验数据均以平均值±标准差表示，并通过spss19.0软件进行统计分析。采用T检验和单因素方差分析（ANOVA），结果

3.1对RAW264.7细胞存活率的影响

从表1可以看出，MTT试验表明牛膝水煎剂组和甾酮组的浓度小于500μG/ml时没有明显的细胞毒性，以及对细胞的影响存活率在实验允许范围内。因此，牛膝水煎剂高剂量组和甾酮组分高剂量组均选择500μG/ml为初始质量浓度，乘以稀释比。因此，选择625μG/ml（对照组）、500μG/ml（高剂量组）、250μG/ml（中剂量组）、125μG/ml（低剂量组）

3.2对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响

从表2可以看出，LPS可诱导RAW264.7细胞释放NO的增加，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义（P＜0.01）；与模型组（LPS组）比较，高、中、低剂量组牛膝水煎液与高，中、低剂量组甾酮组分均能显著抑制RAW264.7细胞分泌no的量（P<0.01）（

3.3对LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-1β的影响从表2中可以看出，LPS能诱导RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-1β之间存在显著差异模型组（LPS组）和空白对照组（P＜0.01）；对炎症因子TNF-α与模型组（LPS组）比较，牛膝汤高、中、低剂量组、高、中、低剂量组的甾体成分及TNF-α水平均表现出非常显著的抑制作用（P<0.01）；发炎因子IL-1β为高，牛膝汤中、低剂量组具有高甾酮成分。中、低剂量组与模型组之间的IL-1比较已记录在β以上。该水平也显示出非常显著的抑制作用（P<0.01）（

4.讨论

牛膝具有苦、甜、，酸溜溜的天性。回归肝肾经络。用于闭经、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力、淋病综合征、水肿等疾病。可减轻淋病综合征的各种症状，对热淋病、石淋病有良好疗效。它是治疗淋病综合征的常用药物。现代医学表明炎症是许多不同类型疾病的共同病理基础。牛膝入血，善降，疏通经络，粉碎血巢。临床上用于治疗各种医学疾病。它治疗的许多疾病都涉及炎症反应，但关于牛膝抗炎作用的报道很少，因此有必要探讨牛膝的抗炎作用，明确其作用机制和药效的物质基础具有重要意义（

巨噬细胞是一种异质性免疫细胞。在体内外不同环境的影响下，它们可以极化为不同的不同的表型并参与生理和病理反应。从活化方式上可分为经典活化巨噬细胞和选择性活化巨噬细胞。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层厚厚的脂多糖。它作用于被革兰氏阴性细菌感染的机体的细胞膜受体，可导致严重的炎症感染[9]。它诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生一系列炎症反应。LPS激活巨噬细胞是一个复杂的信号转导过程，是介导全身炎症反应综合征的主要启动子，引起细胞合成和释放大量的细胞因子炎症因子如no，导致强烈的氧化应激反应，最终导致细胞凋亡和坏死[10-11]。No是一种具有生物活性的气体分子。大量no的产生与炎症密切相关。在急性炎症部位，通过细胞毒作用引起细胞损伤，进而引起炎症相关疾病的发生和发展[12]，IL-1βTNF是介导炎症反应的主要促炎因子α是多种免疫或非免疫细胞产生的细胞因子。它是炎症反应过程中最早、最主要的内源性介质。它具有强烈的炎性损伤作用，是临床上最强的药物之一体内炎症介质[13-16]（

现采用牛膝汤及其甾体成分诱导LPS，研究牛膝汤及其甾体成分的抗炎作用。结果表明，牛膝水煎剂和甾酮组分在500mg/L以下浓度范围内对RAW264.7细胞无明显毒性，对存活率的影响在实验允许范围内。与模型组相比，牛膝汤高、中、低剂量组及牛膝甾酮组均能显著抑制RAW264.7细胞中NO和TNF-α、IL-1β的表达，因此，牛膝汤具有明显的抗肿瘤作用牛膝和牛膝甾酮组分能显著降低RAW264.7细胞中的NO和TNF-α、IL-1β，具有一定的抗炎作用，并表现出良好的剂量依赖性。因此，牛膝具有抗炎作用。其物质基础是甾酮组分，其机制可能与抑制活化巨噬细胞中的炎症因子no和TNF-α、IL-1β有关。为进一步研究牛膝（

的抗炎作用提供了理论基础。研究牛膝汤和甾酮成分对炎症的影响脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞因子，并探讨牛膝的抗炎作用鬼针草及其甾酮成分。方法：体外培养RAW264.7细胞。MTT法检测牛膝汤及其甾体成分对RAW264.7细胞存活率的影响，Griess法检测炎症反应产生的no含量，ELISA法检测细胞上清液中IL-1、TNF-α含量。结果：牛膝水煎剂和甾酮组分能显著抑制LPS（P<0.01）、β（P<0.01）、TNF-α（P<0.01）诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌no和IL-1，且具有良好的剂量依赖性。结论：牛膝水煎剂和甾酮组分对RAW264.7细胞无明显毒性作用过滤范围小于500mg/L。牛膝水煎剂和甾酮成分能抑制no、IL-1β和TNF-α的分泌，具有抗炎作用（

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