体内药物分析是通过分析手段了解药物在体内（包括实验动物）数量和质量的变化，获得药代动力学、代谢模式、途径等各种参数和变化信息。这有助于从药物生产、实验、研究和临床等方面对所研究的药物进行评价，并有助于药物的改进和发展（

体内药物分析任务和对象的特点：

1.所测定的药物及其代谢物的浓度或活性极低（

2.样品中有各种物质直接或间接影响测定结果，其中大部分需要分开纯化（

3。当样品量较少时，很难再获得相同的样品，特别是在连续测定（

4中。工作量大，随着工作的进一步发展（

5）往往要求快速提供结果，特别是在毒物检测工作（

6）中，实验室应具有多种检测方法，它能进行多项分析工作（不易处理和澄清的测定数据（

的类型、样品的采集和贮存

I）。样本类型及选择原则：

（I）血液样本：血浆和血清是体内dr最常用的样本ug分析，其中等离子是最有选择的。血浆中药物浓度可以反映药物在体内（靶管）的状态。此外，有关血药浓度的数据也有很多报道，可供参考。血浆是全血，用肝素、柠檬酸、草酸盐等抗凝剂离心，量约为全血的一半。血清是在纤维蛋白原的影响下在血液中，造成血凝块，离心分离。当血凝块凝固时，很容易造成药物吸附的丧失。全血中还应加入抗凝剂以防止凝血。对大多数药物来说，血浆浓度与红色的浓度成正比血细胞，所以全血的测定不能提供更多的数据，而全血的纯化比血浆和血清更困难，尤其是溶血后，血红蛋白等因素可能会影响测定。但是，有些药物可以与红细胞联合使用，或者血浆和血细胞的分布比例因患者而异。应使用全血。采血量会受到一定的限制，采血时间间隔往往因测定目的不同而不同。目前，原型药的总量大多是确定的。当药物与血清蛋白的结合率稳定时，blo中药物的总浓度od能有效表达游离药物浓度。但对于低蛋白血症或尿毒症患者，如果药物结合率降低，游离药物浓度在总血药浓度中会显著升高，这通常是安全有效的（

（2）尿液：尿液测定主要用于药物剂量恢复的研究，肾脏清除率和生物利用度，以及代谢物类型的测定。体内药物清除主要通过尿液排出，药物可以原形（母体药物）或代谢物及其结合物的形式排出。尿液中药物浓度高，采集量大，但尿液中药物浓度低变化很大。因此，宜测定一定时期内尿液中药物总量（如8小时、12小时、24小时内的累积量），并记录排尿量和尿液中药物浓度。尿药浓度的变化不能直接反映血药浓度，受试者的肾功能会影响药物的排泄。尿液中的药物大部分是结合的，在测定前应先将结合的药物解离。另外，不可能在短时间内多次收集尿液，也很难掌握排尿时间（尤其是婴儿）。同时，收集uri也不容易唾液：唾液中药物的浓度通常与血浆中药物的浓度有关。样品很容易得到，没有损坏，特别是对儿童。在某些情况下，血浆中的游离药物浓度可以从唾液浓度推断出来。但唾液中某些高蛋白结合率药物的浓度远低于血浆中的浓度，需要高灵敏度的检测方法。唾液pH 6.9± 主要电解质为Na+、K+、Cl-、HCO3-等，主要有机成分为粘液和淀粉酶。采样时间一般为漱口后15分钟，采集自然流出口腔或经舌头在口腔内搅拌后流出的混合唾液（a s吸液管中吸附的少量唾液用稀释液冲洗掉），以2000-3000转/分离心15分钟，仔细吸取上清液，进一步分离纯化。也可使用物理（石蜡切片、小块聚四氟乙烯或玻璃大理石）或化学（酒石酸、维生素C）短时间内可获得大量唾液，但药物浓度也可能受到影响（

（4）其他：牛奶、动物器官组织匀浆，etc（

2.样品贮存及稳定性考察：取样后最好立即分析，有时冷藏（4）℃) 冷冻（-20）℃) 不能完全保证样品不会改变。尿液是一种很好的细菌生长型流感id.如果样品需要收集24小时或更长时间或不能立即测定，则应储存在冰箱或防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿）中。分析样品的贮存应考虑贮存条件；样品在贮存过程中对分析结果的影响；评价样品稳定性时会出现哪些问题；如何防止或纠正不稳定样品的分析结果（

测定前的样品制备

除了少量经简单处理后直接测定的体液外，通常需要在测定的最后一步即分离前进行适当的样品制备，提纯必要时对待测组分进行离子、浓度和化学修饰，以创造良好的测定条件（

1.样品的制备应考虑：药物的理化性质、待测物质的浓度范围、药物测定的目的，选择的生物流体和组织的类型，以及样品制备和分析技术之间的关系（

2.蛋白质处理：它是测定血浆、血清、血清中药物的第一个处理步骤，全血和组织匀浆（添加沉淀剂和变性试剂：硫酸铵是一种经典的蛋白质沉淀剂，它与蛋白质分子竞争水分使蛋白质沉淀。阴离子沉淀剂（三氯乙酸、高氯酸、钨酸、焦磷酸）和带电蛋白质在等电点的pH值下形成不溶性盐；相反，阳离子沉淀剂（含锌盐和铜盐）在高于蛋白质等电点时形成不溶性盐。相关机理尚不十分清楚（

（2）加入可与水混合的有机溶剂：当乙醇过量时，可释放与蛋白质结合的药物。混合液可以离心，上清液（含药物）可以提取，但这不能解决样品纯化的问题。蛋白质沉淀法回收率低r类药物具有较强的蛋白结合能力。酸二也被用于药物从蛋白质结合位点释放，但它往往导致药物的分解（

（3）酶解组织：枯草杆菌蛋白酶在蛋白水解酶中不仅能水解组织，而且能释放药物。优点：1、由于在稳定的条件下进行，可避免部分药物在酸性条件下水解和在较高温度下降解；2.能显著提高蛋白质结合率高的药物的回收率；3.有机溶剂可直接提取消化液，无乳化危险；4.使用高效液相色谱时，无需进行过多的纯化操作。d缺点是不适用于某些在高pH下易水解的药物（提取：

（1）溶液pH值的调节：最佳pH值的选择主要与药物的pKa值有关。当pH值等于pKa时，50%的药物以非电离形式存在。基本药物的最佳pH值为比pKa值高1～2ph单位；相反，它要低1-2个单位。它能使90%的药物以非电分离的形式存在，且易于溶剂萃取。对于强碱性药物，通常采用“离子对”技术进行提取和定量。体内有很多酸性物质，在碱性条件下是提取不出来的，所以最好是提取在高pH值（萃取溶剂的极性）条件下：选择第一种萃取溶剂可以减少后续的净化操作，液-液萃取中经常使用极性较低的溶剂。加入少量醇可以克服极性溶剂萃取能力低的缺点，减少药物在容器表面的吸附损失。也有不同极性的混合溶剂用于提取药物和纯化脂肪酸（

（3）提取技术：由于体液样品量少，药物含量低，一次分析大量样品。与常量和微量分析法相比，重复提取法通常不适用用于提取，提取多为一次（最多两次）。改变pH值后，从有机相到水相只进行一次萃取。一般不认为“全药提取”，但测定含量时应准确加入提取溶剂，并对提取物进行定量分离。为避免进样误差，提取前加入等量内标物，测定待测组分的峰高（或峰面积），将浓度与内标物的峰高（或峰面积）进行比较，绘制标准曲线。这样，即使有少量的损失在一系列操作中，对比度值的影响很小。混合时，试管可在密塞条件下平放在振荡器中，振荡时间和强度视情况而定。理想而实用的提取方法和时间可通过“药物转入溶剂的量”和“混合时间”（

（IV）提取溶剂的蒸发量）来选择：提取液一般为几毫升，不能用GC或HPLC直接测定，因此有必要采用浓缩法，溶剂通常采用真空蒸发（注意沸腾）或氮气流动吹扫

四、固相分离：样品经固相pha预处理硒分离法，将待测组分从水相中分离出来。通常采用柱分离法进行操作，因此有时也称为固相萃取柱法。这种色谱柱可分为两种类型：一种是将所有样品保留在色谱柱上；其中一个只封锁了毒品和相关物质。填料塔中常用的固相分离材料有氧化铝、活性炭、硅藻土、离子交换树脂、非离子树脂和凝胶等。在第一类色谱柱中，亲水性填料（如硅藻土）通常用于捕获所有样品。所有的样品都吸附在固体颗粒表面形成一层薄薄的一层，即使样品中有水。一种不溶于水的有机溶剂，如氯乙烷，被用来将药物滤入色谱柱。第二种色谱柱选择性更强，可以用疏水性物质或离子交换树脂填充，以保留药物和有关物质。常见的疏水化合物是活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶。疏水柱可以吸附样品中的亲脂性药物，然后用有机溶剂进行洗脱分离。离子交换柱适用于高极性和可电离的药物（

5，按分子大小分离-血浆中游离药物的测定：超速离心，平衡透析，有限的外部过滤离子（超滤）和凝胶过滤。上述方法也可用于测定药物蛋白结合率（导致分析物丢失的因素：

（1）吸附：药物，特别是脂肪胺和硫化物，会吸附在玻璃或橡胶塞的表面。硅烷化可以降低玻璃的表面，在非极性溶剂中加入少量极性溶剂可以降低药物的吸附。血样中红细胞和纤维蛋白原凝块的形成常常导致分析物的共沉淀。因此，提取前应将全血样品加入缓冲液中。这样，血细胞就分散了，药物就可以被解吸了降低血细胞表面共沉淀的损失。一定离子强度的缓冲液在蛋白质变性时可形成松散的絮状物，可减少药物的物理滞留和共沉淀损失（化学降解：药物的化学和生物不稳定性往往导致化学降解；还应注意光化学和热稳定性的损失（特别是净化过程中强酸和强碱中和产生的热量）。样品制备应尽量在温和的条件下进行，以避免药物发生部分分解和开环，有些药物需要避光操作（

（3）der）试管反应：由于反应不完全，待测药物仅部分转化为所需产物或形成副产物。有时当过量的衍生化试剂通过蒸发去除时，衍生化试剂与溶剂形成共沸混合物，导致损失（

（IV）络合作用：有些药物会与重金属离子络合或与内源性大分子相互作用。虽然这种情况很少遇到，但在某些样品制备（

（V）蒸发中，它往往是药物损失的一个因素：一些药物本身的挥发（如安非他明）或蒸发后的残留物不能在加入的小体积溶剂中完全溶解；或因沸腾而损失f真空浓缩引起的溶液；或者在吹氮过程中，药物会以气雾剂的形式逸出（

（VII）样品污染：

（I）塑化剂：发现一些塑料血样采集管含有3-（2-丁基羟乙基）磷酸盐等。，提高了药物的分配系数和溶剂提取方法的变异系数（从5%提高到20%）（（2）脂肪酸和酯类：血样中的浓度约为350μ G/ml（10-3mol/L），比受试药物高102-103倍。它经常出现在色谱图中（溶剂中的杂质：由于溶剂和其他试剂的体积较大，即使原始杂质浓度当使用柱时，反应温度低，杂质浓度降低或杂质浓度降低，浓度明显增加，干扰测定。更为严重的是，每批溶剂或试剂中的干扰物质不同，影响了不同实验室和分析人员的实验结果。解决方法是使用高纯度溶剂（价格昂贵），有时使用全玻璃仪器重新蒸馏后再使用。二是采用专属检测法（

（四）化学衍生引起的杂质：由于试剂未经纯化，在色谱分析中常出现额外的杂质峰（污染l实验室环境、器具、材料：实验室清洁剂、润滑油、滤纸、玻璃器皿不够清洁，蒸馏水不够纯净，etc（

设计和评价体内药物分析方法

1.建立分析方法的依据：

（1）重视并做好文献的总结和整理（

（2）充分了解待测药物的特性及其在体内的存在（

（3）应规定测定的目的和要求（4）实验室条件（

2.方法建立的一般实验步骤：

（1）纯品测定：按规定用一定量的纯品测定提出的方法。浓度与响应值（如吸光度、峰高或峰面积等）之间的关系、浓度的线性范围、最佳浓度、灵敏度、最佳条件（pH、温度、，反应时间）等（

（2）用纯化后的空白样品测定（

（3）加标后的空白样品测定：加入一定量的标准品后测定血样和其他样品，得到样品回收率数据，并检查是否有生物活性样品干扰测定（

（IV）体内真实样品的测定：有时，用体外建立的方法测定在体内获得的真实样品，会得出错误的结论。因此，应强调对药物的体内过程有一定的了解。有时，用已被证明适用于体内真实样品测定的具体步骤和方法作为对照，以检验所建立方法的实际可行性（

3.方法的评价：

（1）准确度：测量结果与真实值的一致性。一般回收率间接反映了测定的准确度；它也可以通过与其他已建立的方法（参照法）的比较来体现。100%的回收率当然是好的，但很难做到o实现。保持测量稳定很重要（

（2）精密度：测定结果与平均值之间的偏差程度。测量误差越小，测量要求越高（成本越高）；浓度与RSD呈反比关系，RSD小于10%的方法是可以接受的（

（3）灵敏度：“一种方法可以检测到最少量的相关化合物”。常用检测限（LOD）或定量限；定量限）。LOD范围为10-9g至10-18g（

（4）特异性或选择性：这意味着信号（反应）对受试药物具有特异性。如果有干扰，就要改进测定方法或采用具有分离能力的方法（如色谱法的特异性高于吸收分光光度法）或特异性较强的方法（

（V）比较不同方法测定结果的相关程度γ( 相关系数表示相关程度。γ 一般要求为0.95以上（另外，方法的可靠性、每次样品测定的耗时、操作的难度、技术要求、仪器设备的要求等，分析质量控制和质量保证已成为体内药物分析的重要组成部分分析。对仪器、试剂、方法和操作技术进行系统的分析质量管理，可以监督分析质量的状况，提高人们的警惕性，促进人的发展。我们需要改进分析工作的方方面面。也就是说，分析质量管理的短期目的是通过对测量结果的分析来评价测量结果，并根据设定的指标来确定结果，从而保证测量结果的质量。长期的目的是通过质量管理，找出和分析“分析质量差”的原因，从而改进实验设计和测定质量（

a.q.c.可分为nto内部质量控制和外部质量控制。内部质量控制是指实验室内部的质量检查，也是保证实验室间结果可比性的依据（外部质量控制）。中心实验室或配合实验室根据各实验室的内部质控情况，每年发放一次或两次标准对照品，并进行分类分析。然后对各实验室提供的分析结果进行综合和统计处理，并将结果及时发送给各实验室，以便发现一些系统误差，评价分析方法和分析数据的质量（

需要指出的是，a.q.c.工作本身只能进行检验分析结果的质量，但不能直接提高分析结果的质量（

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