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由北京天坛制药生物技术开发公司（

1.1.3培养基、试剂血平板琼脂（郑州安图生物技术有限公司）、麦康凯琼脂（北京奥博生物技术有限公司）、M-H琼脂（北京奥博生物技术有限公司）提供，M-H肉汤（青岛高新区海博生物科技有限公司）、G-N富集液（广东环凯微生物科技有限公司）、革兰氏染色液（郑州丽丽生物工程有限公司）（

1.1.4仪器：sw cj jc超净工作台、pyx DHX防水电恒温培养箱，便携式压力蒸汽灭菌器，dzf-6050真空干燥箱，全自动电子分析天平，新飞冰箱erator等（

1.2方法

1.2.1菌液的制备将从鸡中分离的大肠杆菌接种于MacConkey琼脂平板上，37℃培养℃ 选择单个菌落接种于G-N富集液中，培养16-18h，37℃过夜℃ 使菌液浓度等于108cfu/ml。试验期间，将稀释菌液稀释1000倍，使稀释菌液浓度为105cfu/ml[5,6]（

1.2.2药物储备液的制备[5，6] 用分析天平准确称取适量药物后，进行无菌操作，使其溶于适当的溶剂中，于4℃冰箱保存℃ 待命。1.2.3采用CLSI（m100-s16）推荐的方法进行ESBLs表型筛选。将富集培养液均匀涂于M-H琼脂上，采用标准圆盘扩散法。分别将头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南敏感片贴于平板上。37℃过夜培养℃, 细胞在37℃孵育℃, 如抑菌圈直径符合下列条件之一，可怀疑为产ESBLs菌株：头孢噻肟≤ 27mm，头孢他啶

≤ 22mm，头孢曲松≤ 25毫米，氨曲南≤ 27mm（

1.2.4 ESBLs确证试验（双纸片协同法）[7]采用国家临床实验室按照CLSI（m100-s16）推荐的方法，将疑似产酶的富集培养菌液均匀涂于M-H琼脂平板上，将头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸敏感片分别贴于同一M-H琼脂平板上，在37℃下孵育过夜℃, 当两组中任一组克拉维酸的抑菌圈直径大于或等于5mm时，均能产生ESBLs（

1.2.5。用二倍稀释法测定氟苯尼考对7株大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）。在实验中，细菌溶液的浓度应be 105 CFU/ml，置于37℃ 恒温培养箱，观察18-24小时后，能抑制细菌生长的最低药物浓度为mic（

2结果分析

2.1 ESBLs表型筛选试验和确证试验，抑制带直径鸡大肠埃希菌ESBLs表型筛选和确证试验结果分别见表1和表2（

。从表1可以看出，头孢噻肟有6株抑制带直径小于或等于27mm的细菌，头孢他啶抑菌圈直径≤22mm的细菌7株，抑菌圈直径≤22mm的细菌5株头孢曲松小于或等于25mm，氨曲南（

的抑菌圈直径小于或等于27mm的菌株有6株，从表2可以看出，7株疑似产ESBLs菌株在加入克拉维酸后抑菌圈直径明显增大。6株头孢噻肟/克拉维酸的抑菌圈直径比头孢噻肟大5mm，5株头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈直径比头孢他啶大5mm。7株产ESBLs疑似菌株均为ESBLs阳性（

2。2药敏试验

结果7株产ESBLs菌株单药和复方药的MIC值临床分离的大肠杆菌scherichia coli如表3所示，从表3可以看出，7株大肠埃希菌对多肽colistin高度敏感，对头孢菌素头孢噻呋的耐药率为100%，对氨基糖苷类丁胺卡那霉素的耐药率为71%，对四环素、多西环素、，喹啉和磷霉素分别为57%、100%和57%。这7株产ESBLs菌株不仅对该病原菌具有耐药性，而且对该病原菌也具有耐药性β- 内酰胺对抗生素具有耐药性，并表现出高度的多药耐药性。当氟苯尼考与粘菌素混合时，氟苯尼考与粘菌素（1:1）的MIC与粘菌素几乎相同。当氟苯尼考与粘菌素（1:2）混合时，其抑菌效果最好粘菌素的MIC普遍降低，因为粘菌素的剂量增加了一倍，可见本实验中单独使用粘菌素可抑制7株产ESBLs大肠杆菌。氟苯尼考与头孢噻呋合用不增强抗菌活性。氟苯尼考与丁胺卡那霉素按3种比例混合时，菌株43的抗菌活性提高，当氟苯尼考与丁胺卡那霉素的比例为1:2时，mic值下降幅度最大；氟苯尼考与强力霉素按3种比例混合时，7株菌株的mic值均有不同程度的下降，特别是当氟苯尼考与强力霉素的比例为1:2时，氟苯尼考与石君净的混合比例为1:2时，其mic值明显降低菌株57略有下降。当氟苯尼考与磷霉素配伍时，当氟苯尼考与磷霉素的比例为1:1和1:2时，只有2株菌株的MIC下降（

3

1）7株E。本实验分离的大肠杆菌均产ESBLs，检出率高达100%，表明产ESBLs菌株呈线性上升趋势。近年来，随着第三代动物特异性广谱头孢菌素在鸡病防治中的广泛应用和第三代医用头孢菌素的滥用，大肠杆菌的耐药性相当严重，给临床治疗带来困难。这些药物大多是抗药性的t细菌产生ESBLs。自1983年德国首次发现ESBLs以来，国内外报道越来越多，越来越多的产ESBLs细菌逐渐引起人们的关注（从鸡中分离到的7株产ESBLs大肠杆菌对头孢噻呋、氯霉素、氯霉素、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟肟、头孢噻肟、头孢噻肟，氟苯尼考和阿米卡星对四环素、强力霉素的耐药率分别为71%、57%、100%和57%。可见产ES-BLS菌株不仅对大肠杆菌具有耐药性β- 内酰胺酶对抗生素耐药，并表现出多重耐药性。这与胡公正等人的有关报道相一致。药物耐药机制之一抗生素是由产酶菌株使药物失活。产ESBLs菌株能灭活青霉素或头孢菌素β- 内酰胺环断裂β- 内酰胺药物失效。但产酶菌对多种药物的多药耐药机制有待进一步研究（

3）氟苯尼考是一种广谱的动物抗生素。它是氯霉素的同系物。其作用机理和抗菌谱与氯霉素和甲砜霉素相似。氯霉素有严重的不良反应导致再生障碍性贫血，氟苯尼考弥补了这一不足。因此，氟苯尼考替代氯霉素用于动物疾病的预防和治疗，成为一种新的药物nd在兽医临床中起着重要的作用[8,9]。近年来，由于抗生素的滥用，产生了大量的耐药菌株，氟苯尼考

的抗菌作用逐渐减少，人们不得不根据本实验的结果寻找新的解决方案，当氟苯尼考与6种药物合用时，氟苯尼考与头孢噻呋合用完全无效，这与理论相符。头孢噻呋为Ⅰ类速效杀菌剂，氟苯尼考为Ⅲ类速效杀菌剂，Ⅲ类药物与Ⅰ类、Ⅲ类药物合用时能迅速阻断细菌的蛋白质合成，因此，与Ⅰ类药物合用时，细菌的蛋白质合成受到抑制后者的活性可能会减弱，因此不宜同时使用。其他几种药物能提高某些细菌

的抗菌活性，效果最好的是1:2，其中氟苯尼考与强力霉素1:2的组合对7株细菌的MLC值下降幅度最大，是6种组合中效果最好的，这与袁莉等[10]的报道一致。对氟苯尼考耐药的产ESBLs菌株经联合用药后，抗菌活性明显提高。可见，联合用药是控制产ESBLs菌株

感染的有效途径

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